Skip to content

Mutacje w genie ciężkiego łańcucha Mu u pacjentów z agammaglobulinemią cd

3 tygodnie ago

584 words

Wyznakowany zamplifikowany DNA zmieszano z buforem do ładowania (95% formamidu, 20 nM EDTA, 0,05% błękitu bromofenolowego i 0,05% ksyleno-cyjanolo-FF) w stosunku 1: 5, denaturowano przez pięć minut w 90 ° C, umieszczono na lodzie, załadowano na żel MDE (AT Biochem, Malvern, Pa.) i poddano elektroforezie w 4 ° C w buforze 0,6 x TBE (bufor x TBE 89 mM TRIS, 89 mM boran i 2 mM EDTA) w 2 do 4 W przez noc . Żele przeniesiono do papieru 3MM (Whatman, Clifton, NJ), wysuszono i wystawiono na działanie filmu Kodak X-OMAT (Kodak, Rochester, NY). Krótka analiza powtórzeń tandemowych
Pary starterów dla polimorfizmów powtarzających mikrosatelitę w pobliżu genów dla Syk (D9S257, D9S910 i D9S922), mb-1 (D19S178 i D19S246) i EBF (D5S1471, D5S820 i D5S1456) i genu łańcucha ciężkiego mu (D14S611) i D14S118) uzyskano z Research Genetics (Huntsville, Ala.). Do amplifikacji DNA wyznakowanego 32P stosowano PCR, który analizowano na denaturującym 6% żelu poliakrylamidowym.
Analiza Southern Blot
Standardowe metody zastosowano w analizie Southern blot. Sondy stosowane do badania genów pod kątem VH6 i JH4 oraz genów regionu stałego dla mu, delta i gamma zostały wcześniej opisane.21-23 Aby uzyskać sondę dla regionu DH, produkt PCR o wielkości 500 pz w oparciu o sekwencja opisana przez Ichihara i wsp. 24 została wytworzona z użyciem startera do przodu 5 CAGGTACAGCTGTAGAGA3 i startera wstecznego 5 AGACAGCAGCCTTGAGAG3 .
Klonowanie i sekwencjonowanie
Produkty PCR od pacjentów z widocznymi przesunięciami pasm w analizie SSCP klonowano do wektora TA (Invitrogen, San Diego, CA) i sekwencjonowano z użyciem starterów M13 lub oligonukleotydów z genu ludzkiego łańcucha ciężkiego. Wszystkie mutacje zostały potwierdzone przez drugą, niezależną reakcję PCR.
Barwienie immunofluorescencyjne
Limfocyty krwi obwodowej inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem anty-CD19 i kozią przeciwludzką IgM, obie skoniugowane z fikoerytryną. Komórki szpiku kostnego barwiono przeciwciałami anty-CD19, anty-CD34 i poliklonalnymi przeciw ludzkim łańcuchom lekkim skoniugowanym odpowiednio z fikoerytryną, białkiem chlorofilowym perydyniny iz izocyjanianem fluoresceiny. Transoksynukleotydową transferazę jądrową (TdT) i łańcuch ciężki mu cytoplazmatycznego wykrywano specyficznymi przeciwciałami skoniugowanymi z fikoerytryną i izotiocyjanianem fluoresceiny stosowanym po tym, jak komórki stały się przepuszczalne przez OrthoPermeafix (Ortho Diagnostics, Raritan, NJ). Immunofenotypy analizowano za pomocą cytometru przepływowego FACScan z oprogramowaniem Lysis II (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Wyniki
Analiza sprzężeń
Pacjenci z rodziny A byli spokrewnieni przez linię matczyną; jednak analiza sprzężeń wykazała, że defekt w tej rodzinie nie został odwzorowany na locus agammaglobulinemii sprzężonej z X w Xq22, a genomowy DNA od Pacjenta 2 nie wykazał mutacji w Btk. Dlatego do analizy wybrano serię potencjalnych genów kodujących inne białka zaangażowane w transdukcję sygnału przez powierzchniowy receptor immunoglobulin. Szczególny nacisk położono na geny, które ulegają wczesnej ekspresji w różnicowaniu komórek B i genom specyficznym dla linii komórek B. Analizę sprzężeń przeprowadzono z wysoce polimorficznymi krótkimi powtórzeniami tandemowymi zlokalizowanymi w pobliżu genów dla Syk, cytoplazmatycznej kinazy tyrozynowej kodowanej przy 9q2225; CD79a (znany również jako mb-1 lub Ig.), niezmienny składnik kompleksu antygenu-receptora komórek B, który został zmapowany do 19q13.226; EBF, czynnik transkrypcyjny wymagany do transkrypcji CD79a kodowany w 5q3427; i geny ciężkołańcuchowe immunoglobulin w 14q32.3.28 Region wykazujący najlepsze wiązanie z genem choroby w Rodzinie A był w pobliżu locus łańcucha ciężkiego immunoglobuliny na długim ramieniu chromosomu 14; gdy użyto haplotypów pochodzących z polimorfizmów w D14S611 i D14S118, zaobserwowano tylko jeden crossover
[przypisy: ambroksol, diltiazem, suprasorb ]
[hasła pokrewne: luxvet, mimoza stalowa wola, saniko myszków ]

0 thoughts on “Mutacje w genie ciężkiego łańcucha Mu u pacjentów z agammaglobulinemią cd”

  1. [..] odnosnik do informacji w naukowej publikacji odnosnie: stomatolog bielany warszawa[…]